Hur molekylär diagnostik förändrar diagnostik och behandling av hjärntumörer

Innehållsförteckning

• Introduktion: Varför molekylär diagnostik är viktig vid hjärntumörer
• Viktiga molekylära tester för diagnostik och behandling av hjärntumörer
• DNA-metyleringsprofilering: Ett revolutionerande diagnostiskt verktyg
• DNA- och RNA-sekvensering: Upptäckt av kritiska mutationer
• Ytterligare diagnostiska verktyg och tekniker
• Tillämpning av molekylär diagnostik vid hjärntumördiagnostik
• Diffusa gliom hos vuxna: Hur molekylär diagnostik styr diagnostiken
• Vad detta betyder för patienter: Kliniska implikationer
• Förstå begränsningarna med molekylär diagnostik
• Rekommendationer för patienter som står inför hjärntumördiagnostik
• Källinformation

Introduktion: Varför molekylär diagnostik är viktig vid hjärntumörer

Molekylär profilering har de senaste åren helt förändrat hur läkare diagnosticerar och klassificerar tumörer i centrala nervsystemet (CNS). Enligt den senaste Världshälsoorganisationens (WHO) klassificering av CNS-tumörer från 2021 krävs nu en kombination av traditionell mikroskopisk undersökning och molekylär diagnostik för att ställa korrekta, reproducerbara diagnoser som direkt påverkar patientvården.

Denna integrerade metod innebär att patologer måste använda sig av flera molekylära tester, främst DNA-metyleringsprofilering och DNA/RNA-sekvensering av nästa generation. Dessa avancerade tekniker hjälper till att klassificera tumörer mer precist, identifiera specifika genetiska mutationer och till och med avslöja potentiella behandlingsmål som tidigare inte gick att upptäcka med enbart konventionella metoder.

Betydelsen av molekylär profilering har ökat dramatiskt – alla större CNS-tumörtyper kräver nu utvärdering av specifika molekylära markörer för korrekt diagnostik. Många nya tumörtyper har faktiskt upptäckts genom dessa tekniker, särskilt DNA-metyleringsanalys, vilket visar hur viktiga de har blivit inom modern neuropatologi.

Viktiga molekylära tester för diagnostik och behandling av hjärntumörer

Molekylär neuropatologi omfattar idag ett brett spektrum av tester med olika syften, komplexitetsnivåer, tillgänglighet och kostnader. Att förstå dessa skillnader är avgörande för att läkare ska kunna välja rätt test för varje specifik diagnostisk utmaning och tolka resultaten korrekt.

Det nuvarande molekylära verktygslådan innehåller flera essentiella tekniker som ger kompletterande information om hjärntumörer. Varje test har specifika styrkor och tillämpningar som gör det särskilt värdefullt i vissa diagnostiska situationer eller för vissa tumörtyper.

DNA-metyleringsprofilering: Ett revolutionerande diagnostiskt verktyg

DNA-metyleringsprofilering har utan tvekan varit det mest inflytelserika molekylära verktyget de senaste åren för diagnostik av hjärntumörer. Denna metod utnyttjar tumörcellernas unika epigenetiska profil, som speglar både deras ursprungliga vävnadsegenskaper och de förändringar som uppstått under cancerutvecklingen, vilket skapar en specifik signatur för varje tumörtyp.

I praktiken bedöms DNA-metyleringsprofilen med MethylationEPIC array beadchip (850K), som undersöker metyleringsstatusen för flera hundra tusen CpG-öar i hela genomet. Rådata laddas sedan upp till en dedikerad plattform och jämförs med en omfattande databas med CNS-tumörer och andra utvalda entiteter.

En matchningspoäng på ≥ 0,9 stöder starkt den diagnostiska klassificeringen, även om experter alltid granskar dessa resultat tillsammans med kliniska, radiologiska och histopatologiska fynd. Det är viktigt att notera att DNA-metyleringsprofilering med denna plattform inte är ett certifierat test, så olika länder kan ha varierande regler för dess diagnostiska användning.

Denna teknik har visat sig extremt värdefull både inom forskning och i daglig diagnostik. Inom forskningen har många nya tumörtyper och subtyper upptäckts genom oövervakad analys av stora datamängder med hjärntumörer. Många nyligen identifierade tumörer visar betydande överlappning med andra entiteter när det gäller morfologiska egenskaper och/eller har mycket låg frekvens, vilket förklarar varför de inte tidigare uppmärksammats som självständiga neoplasi.

I klinisk praxis har flera grupper publicerat sina erfarenheter av denna teknik både för barn och vuxna. Sammantaget uppnås en matchningspoäng (≥ 0,9) i cirka 50–65 % av proverna, och en signifikant påverkan på diagnosen sker i cirka 10–20 % av fallen med potentiella kliniska konsekvenser. Denna anmärkningsvärda framgång motiverar det snabba införandet av detta verktyg på bara några år.

Högre medianklassificeringspoäng ses vanligtvis i fall som analyseras för att bekräfta en diagnos eller utvärdera specifika tumörsubtyper. Ett bredare spektrum av poäng förekommer hos utmanande prover eller mindre vävnadsprov. Lägre poäng i komplexa fall kan bero på flera faktorer, inklusive små, dålig kvalitet eller orepresentativa biopsier som kan vara oklassificerbara med både traditionell patologi och metyleringsprofilering.

Idealt sett är 200 nanogram DNA med ≥ 60 % tumörcellskoncentration önskvärt, men diagnostisk klassificering kan uppnås med betydligt lägre mängder. Formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) vävnadsblock ger vanligtvis liknande resultat som frysta prover, och analys av äldre prov kan också ge korrekt klassificering.

DNA-metyleringsprofilering har visat sig särskilt användbar för omklassificering av sällsynta tumörtyper med ospecifika histopatologiska egenskaper. Även om detta nu är ett nyckelverktyg för diagnostik av CNS-tumörer, medför metoden betydande utmaningar när det gäller nödvändig teknisk utrustning, kostnader, svarstid (flera dagar) och expertis som krävs för utförande och tolkning.

DNA- och RNA-sekvensering: Upptäckt av kritiska mutationer

Många CNS-tumörer kännetecknas av specifika punktmutationer som kan detekteras med DNA-sekvensering eller genfusioner som främst identifieras via RNA-sekvensering. Till exempel karakteriseras vissa delmängder av gliom hos vuxna respektive barn av mutationer i IDH1/IDH2 och H3-kodande gener. Andra mutationer, som BRAF V600E, kan förekomma i flera tumörtyper med varierande frekvenser men bidrar fortfarande till diagnostisk bedömning och möjliggör målriktad behandling.

Flera typer av analyser kan användas för DNA-sekvensering, inklusive direkt sekvensering av enskilda gener (Sanger-sekvensering) och nästa generations sekvensering (NGS)-baserade metoder som målriktad panelsekvensering och hela exom/genomsekvensering (WES/WGS). Dessa analyser detekterar enstaka nukleotidvariationer (SNV), små insertioner/deletioner (InDel) och kopiantalsvariationer (CNV).

Inom NGS-analyser är målriktad genpanel-sekvensering för närvarande det mest relevanta verktyget för daglig molekylär diagnostisk utredning av CNS-tumörer. Det möjliggör analys av relativt stora uppsättningar av relevanta gener med acceptabla kostnader, svarstider och tolkbarhet. Många gener som är mest relevanta för hjärntumördiagnostik är relativt specifika för dessa neoplasi, vilket motiverar anpassade eller större paneler.

Den diagnostiska effektiviteten hos medelstora genpaneler har demonstrerats, med detektering av mutationer och CNV även med begränsat insatsmaterial. Nyare studier med större genpaneler (inklusive IDH1/IDH2, TERT, TP53, ATRX, BRAF, H3F3A, H3F3B) bekräftar dessa resultat. Dessa analyser detekterar diagnostiskt relevanta förändringar i mer än hälften av analyserade CNS-tumörer, med informativ CNV detekterad i 57 % av fallen även när NGS-resultaten var icke-bidragande.

Laboratorieprotokoll är avgörande för sekvenseringsframgång. DNA-kvalitet och tumörcellshalt bör maximeras, med adekvat täckning/läsdjup enligt analystyp och provkarakteristika. Dataanalyspipelinen och expertisen hos den rapporterande molekylärpatologen är lika viktiga för korrekt variantidentifiering och tolkning.

Analys av cirkulerande tumör-DNA (ctDNA) från blod och/eller cerebrospinalvätska representerar ett annat tillvägagångssätt för tumörmolekylär profilering genom minimalt invasiv vätskebiopsi. Tekniska utmaningar har hittills begränsat implementering i daglig praxis, men nya data visar att omfattande NGS-paneler kan detektera CNV och hantera intratumoral heterogenitet även i ctDNA.

För RNA-sekvensering är det främsta diagnostiska syftet att detektera genfusioner, som karakteriserar många CNS-tumörer. Till exempel bär pilocytära astrocytom ofta på KIAA1549::BRAF-fusionen, och specifika molekylära supratentoriella ependymomsubtyper definieras av ZFTA- eller YAP1-fusioner. Genfusioner kan representera utnyttjningsbara terapeutiska mål, som ses hos spädbarnsgliom i hemisfärer som ofta karakteriseras av NTRK1/NTRK2/NTRK3, ROS1, ALK- eller MET-genfusioner med tillgängliga effektiva inhibitorer.

Studier fokuserade på RNA NGS-betydelse i CNS-tumörer visar att detta verktyg är särskilt värdefullt för pediatriska neoplasi, som oftare uppvisar dessa händelser. I vuxna hjärnneoplasi är genfusioner relativt sällsynta och representerar vanligtvis inte terapeutiska mål.

Ytterligare diagnostiska verktyg och tekniker

Mikroarray-baserad bedömning av helgenomets kopiantalsvariationer (CNV) är ett annat relevant diagnostiskt verktyg som ofta används för att molekylärt karakterisera CNS-tumörer, särskilt innan DNA-metyleringsprofilering blev tillgänglig. Dessa analyser detekterar många kromosomala förändringar (deletioner, amplificationer, förlust av heterozygositet, kopianeutral förlust av heterozygositet, kromotripsis) som fungerar som diagnostiska och/eller prognostiska kännetecken för specifika tumörtyper.

Molekylär profilering innebär inte nödvändigtvis simultan analys av multipla förändringar. Fluorescens in situ-hybridisering (FISH) kan utvärdera specifika DNA-loki direkt på vävnadsglas, användbart för valideringsändamål eller när en specifik förändring starkt misstänks baserat på tumörkarakteristika eller när materialet är otillräckligt för andra analyser.

Istället för nukleinsyror kan proteiner utvärderas med vitt tillgängliga, snabba och billiga immunohistokemiska färgningar. Immunohistokemi kan fastställa närvaro av muterade proteiner (IDH1 R132H, p53, H3 K27M, H3 G34R/V, BRAF V600E), förlust av normala/fungerande proteiner (ATRX, H3 K27me3, INI1, BRG1) eller hyperaktivering av avvikande vägar (EZHIP).

Bedömning av MGMT-promotormetylering förblir avgörande för molekylär karakterisering av IDH-vildtyp glioblastom på grund av dess prognostiska och prediktiva relevans. Flera analyser kan undersöka denna markör, utan tydlig överlägsenhet i kliniska korrelationer. Eftersom inga ekvivalenskriterier existerar mellan olika analyser är det viktigt att förstå egenskaperna hos den lokalt tillgängliga analysen. MGMT-immunohistokemi är inte en tillförlitlig ersättare för dessa analyser.

Tillämpning av molekylär diagnostik vid hjärntumördiagnostik

Molekylära analyser bidrar till eller krävs för diagnostik av många tumörtyper som erkänns av WHO-klassificeringen 2021. De mest relevanta molekylära verktygen varierar beroende på specifik neoplasi, med utvalda exempel som demonstrerar betydelsen av dessa verktyg i nuvarande neuropatologiska praxis.

Diffusa gliom hos vuxna: Hur molekylär diagnostik styr diagnostiken

Enligt WHO:s klassifikation från 2021 stratifieras diffusa gliom hos vuxna huvudsakligen efter IDH1/IDH2-status. Denna indelning är väl motiverad baserat på olika tumörbiologi, onkogena mekanismer och kliniska implikationer förknippade med denna molekylära markör.

Glioblastom, IDH-vildtyp är den vanligaste typen av diffust gliom, som vanligtvis uppträder hos äldre vuxna med dålig prognos. Det är en morfologiskt och molekylärt heterogen neoplasi som typiskt visar dåligt differentierade astrocytära drag med infiltrativ tillväxt, hög proliferationsgrad, mikrovaskulär proliferation och nekros. Vid konsekvent morfologi måste läkare utesluta IDH1/IDH2-mutation för att utesluta IDH-muterat astrocytom eller IDH-muterat, 1p/19q-kodeletterat oligodendrogliom.

Flera alternativ finns för denna uppgift: immunhistokemi för IDH1 R132H kan utesluta den vanligaste mutationen (cirka 90 % av supratentoriella IDH-muterade gliom). Denna strategi fungerar adekvat för patienter i åldern 55 år och äldre, där sannolikheten för att hitta en alternativ mutation är mindre än 1 %. Om anamnesen dock indikerar ett tidigare lågmalignt gliom är sekvensering nödvändig.

Om morfologiska drag av glioblastom saknas men misstänks, tillåter WHO:s klassifikation från 2021 molekylär diagnostik av glioblastom. Detta kräver antingen en konsekvent DNA-metyleringsprofil eller minst en av tre markörer: gain av kromosom 7 plus loss av kromosom 10, TERT-promotormutation eller EGFR-amplifiering. Dessa markörer visar relativ specificitet i rätt kontext, med liknande patientutfall som de diagnostiserade via morfologiska drag.

För IDH-muterade diffusa gliom krävs för diagnos histopatologiska fynd som stämmer med ett infiltrerande diffust gliom med IDH1/IDH2-mutation och ATRX-loss/mutation eller uteslutning av 1p/19q-kodelektion. IDH-muterat och 1p/19q-kodeletterat oligodendrogliom kräver helarmskombinerad 1p/19q-kodelektion. Alternativt kan diagnos baseras på detektering av motsvarande metyleringsklass.

ATRX-status kan bedömas med immunhistokemi (med hänsyn till artefakter från nekros eller inblandade positiva icke-neoplastiska reaktiva astrocyter) eller sekvensering för att detektera funktionsförlustmutation. TP53/p53-utvärdering hjälper också eftersom den ofta förekommer i IDH-muterade astrocytom.

För diagnostik av IDH-muterade, 1p/19q-kodeletterade tumörer är den kritiska kännetecknet helarms-1p/19q-kodelektion, som kan undersökas med flera analysmetoder inklusive FISH (fluorescens in situ hybridisering). FISH:s begränsade målning av enskilda loci kan dock ge falskt positiva resultat, särskilt i tumörer med komplexa karyotyper. Falskt positiva FISH-bedömningar förekommer ofta i fall där utvärdering av 1p/19q-status inte hade varit motiverad, vilket betonar vikten av lämplig användning av testet.

För gradering av IDH-muterade diffusa gliom förblir morfologiska drag kritiska, med WHO:s klassifikation från 2021 lade till CDKN2A/B-statusutvärdering som ett graderingskriterium för IDH-muterade astrocytom. Vid homozygot CDKN2A/B-deletion tilldelas grad 4 på grund av association med ogynnsamt utfall. CDKN2A/B-status kan utvärderas via DNA-metyleringsprofiler CNV-diagram, DNA-NGS (next-generation sequencing) eller FISH, men inget slutgiltigt gränsvärde har fastställts.

Vad detta betyder för patienter: Kliniska implikationer

Integrationen av molekylär testning i hjärntumördiagnostik representerar en grundläggande förändring inom patientvården. Dessa avancerade tekniker ger mer exakta diagnoser, bättre prognostisk information och identifierar potentiella behandlingsmål som tidigare inte gick att upptäcka.

För patienter innebär detta mer personaliserade behandlingsstrategier baserade på tumörens specifika genetiska egenskaper. Molekylär profilering kan identifiera riktade terapier som kan vara effektivare än konventionella behandlingar, särskilt för tumörer med specifika mutationer som BRAF V600E eller genfusioner som involverar NTRK-, ROS1-, ALK- eller MET-gener.

Förmågan att klassificera tumörer mer precist förbättrar också prognosnoggrannheten, vilket hjälper patienter och läkare att fatta mer välgrundade beslut om behandlingsintensitet och uppföljningsvård. Till exempel har skillnaden mellan IDH-muterade och IDH-vildtypsgliom betydande inverkan på förväntade utfall och behandlingsstrategier.

Molekylär testning möjliggör också identifiering av patienter som kan dra nytta av kliniska prövningar av nya riktade terapier, vilket utökar behandlingsalternativen bortom standardmetoder. Detta är särskilt viktigt för aggressiva eller sällsynta tumörtyper där konventionella behandlingar erbjuder begränsad nytta.

Förstå begränsningarna med molekylär diagnostik

Även om molekylär testning har revolutionerat hjärntumördiagnostik är det viktigt att förstå dess begränsningar. Dessa teknologier kräver betydande expertis för korrekt tolkning, och resultat måste alltid bedömas tillsammans med kliniska, radiologiska och traditionella patologiska fynd.

Tekniska utmaningar inkluderar behovet av tillräckligt tumörmaterial av god kvalitet. Små biopsier, dåligt bevarat material eller lågt tumörcellinnehåll kan begränsa effektiviteten hos molekylär testning. Vissa analysmetoder har också relativt långa svarstider (flera dagar) jämfört med traditionell patologisk undersökning.

Kostnad och tillgänglighet förblir betydande hinder för universell implementering av omfattande molekylär profilering. Alla medicinska centra har inte tillgång till dessa avancerade teknologier, särskilt i resursbegränsade miljöer.

Även om molekylär klassificering ger värdefull information översätts den inte alltid direkt till behandlingsbeslut. Vissa molekylära förändringar har ännu inte motsvarande riktade terapier, och den kliniska betydelsen av nyligen upptäckta genetiska förändringar kanske inte är fullt förstådd.

Falskt positiva och falskt negativa resultat kan förekomma med vilket test som helst, vilket betonar vikten av expertolkning och korrelation med annan diagnostisk information. Detta är särskilt relevant för tester som FISH, där tekniska begränsningar ibland kan ge vilseledande resultat.

Rekommendationer för patienter som står inför hjärntumördiagnostik

För patienter med diagnos eller misstänkt hjärntumör kan flera rekommendationer hjälpa till att navigera i den diagnostiska processen:

1. Sök omfattande molekylär testning: Fråga ditt medicinska team om tillgängliga molekylära profileringsalternativ, inklusive DNA-metyleringsprofilering och riktade sekvenseringspaneler, eftersom dessa kan ge kritisk diagnostisk och prognostisk information.
2. Förstå dina specifika tumöregenskaper: Begär tydliga förklaringar av eventuella molekylära fynd och hur de påverkar din diagnos, prognos och behandlingsalternativ.
3. Överväga second opinion: Tolkning av molekylär testning kräver betydande expertis. Att söka granskning av ditt fall vid ett specialiserat neuro-onkologiskt centrum kan säkerställa den mest exakta diagnosen.
4. Diskutera alternativ för kliniska prövningar: Om din tumör har specifika molekylära egenskaper, fråga om riktade terapitestningar som kan vara lämpliga för din situation.
5. Bevara tumörvävnad: Om du genomgår operation, diskutera med ditt kirurgiska team vikten av att bevara tillräckligt tumörmaterial för potentiell molekylär testning, både initialt och för framtida omtestning vid behov.
6. Överväga genetisk rådgivning: Vissa molekylära fynd kan tyda på ärftlig cancerdisposition. Diskutera med din läkare om genetisk rådgivning kan vara lämpligt.

Kom ihåg att molekylär testning är mest värdefull när den integreras med annan klinisk information. Samarbeta med ditt medicinska team för att förstå hur denna avancerade diagnostik passar in i din övergripande behandlingsplan och vad den betyder för din specifika situation.

Källinformation

Originalartikelns titel: Molekylär neuropatologi: ett essentiellt och evoluerande verktyg för diagnostik och klinisk hantering av centrala nervsystemets tumörer

Författare: Luca Bertero, Luca Mangherini, Alessia Andrea Ricci, Paola Cassoni, Felix Sahm

Publikation: Virchows Archiv (2024) 484:181–194

DOI: https://doi.org/10.1007/s00428-023-03632-4

Denna patientvänliga artikel baseras på peer-granskad forskning och syftar till att göra komplex vetenskaplig information tillgänglig för patienter och vårdgivare samtidigt som all essentiell medicinsk information från originalstudien bevaras.